Research grants

 

2019

Proton transport and proton-coupled transport (EC, Horizon 2020, Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks, 3 years)

Secure, competitive, and sustainable energy production is a major challenge facing human societies. Biomimetic solutions such as the development of new biofuel cells are hampered by our thus far incomplete understanding of proton transfer reactions. The same holds for health threats to humanity: Curing diseases like cancer, obesity, chronic gastritis, gastric and duodenal ulcers, requires to pharmacologically interfere - in their molecular details - with yet unresolved proton transfer reactions. Here we aim at clarifying the molecular reaction mechanism in the confines of interfacial water layers and proteinaceous cavities with emphasis on arrangement and mobility of proton relay moieties. Achieving this requires an interdisciplinary, multi-level approach comprising cutting edge technologies like second harmonic imaging, single molecule and time resolved fluorescence microscopy and spectroscopy, advanced calculations of proton transfer, bioengineering of membrane channel and transporter containing systems, synthetic design of biomimetic proton channels, solving protein structures and rational drug design. PROTON will train 15 PhD students, who will acquire a solid state-of-the-art multidisciplinary scientific training in all kinds of proton migration/reaction systems, covering from basic science to industrial applications, thus preparing them to generate new scientific knowledge of the highest impact. In addition, practical training on transferable skills will increase their employability and qualify them for responsible positions in private and public sectors. Cross-disciplinary strategies and close collaboration with industry will enable them to resolve the molecular details of proton driven processes in all kinds of settings - enabling the improvement of biomimetic applications – up to fuel cells - and to identify lead substances which may serve to pharmacologically interfere with proton transport through membrane channels and transporters.

 

2017

Inhibitors of lactate and nitrite transporters as novel antimalarial and antibacterial agents (DFG, 3 years)

The spreading of resistant human pathogens is an ever-growing threat. Novel drug targets and modes of action for the treatment of protozoan and bacterial infections are, thus, urgently needed. Very recently, we discovered the missing lactic acid transporter of the malaria parasite Plasmodium falciparum, which completes its vital energy flux, i.e. uptake of glucose, anaerobic glycolysis, and release of lactic acid. The lactic acid transporter was overlooked for decades because the protein is a function-wise untypical member of the exclusively microbial formate-nitrite-transporter (FNT) family, has no resemblance to human transporters, and differs fundamentally in its transport mechanism. Their restriction to protozoa and bacteria and vital roles in metabolism renders FNT proteins novel putative drug targets of high potential. In fact, by a screening program, we have discovered nanomolar small-molecule inhibitors of the malarial PfFNT and validated the protein as a potent novel drug target using live parasites. Within this proposal, we want to expand and re-design the set of PfFNT inhibitors with respect to circumventing an observed target mutation. Additionally, we will generate inhibitors for the Salmonella typhimurium FNT, i.e. a nitrite transporter (NirC). The latter allows the bacteria to thrive inside infected macrophages by disrupting intracellular nitric oxide signaling, which prevents macrophage activation and further immune responses.

 

Biolayer interometry system

Funded by the DFG's "Major Research Instrumentation Programme."

 

2015

Mechanism, proton co-transport and directionality of the formate-nitrite transporter family, FNT (DFG, 3 years)

Our work on the putative formate-nitrite-transporter (PfFNT) from malaria parasites has led to an unexpected breakthrough in the malaria research field. PfFNT has turned into the currently most important candidate as the long-sought lactate-transporter of the parasites und represents a highly promising novel drug target. The grant project focusses on the basic, largely unknown mechanisms of the formate-nitrite-transporter family with respect to anion transport, proton co-transport, and directionality.

 

Structure determination of formate-nitrite transport proteins (BioStructX, EC FP7, 12 months)

Automated protein crystallization screening at the EMBL Hamburg, Germany.

 

2014

Mechanism of aquaporin-mediated drug resistance of trypanosomes (DFG, 3 years)

The treatment of African trypanosomiasis is far from being optimal because the compound set is limited and old (1940s), and has dramatic, even fatal side effects. Our preliminary studies suggest that the discovery by David Horn, Dundee, UK, of aquaporin-mediated resistance (TbAQP2) to pentamidine/melarsoprol can be turned into a new principle to shuttle small (drug-) molecules into the parasite.

 

2013

Crystallization of PfFNT, a lactate transporter from malaria parasites (BioStructX, EC FP7, 15 months)

Automated protein crystallization screening at the EMBL Hamburg, Germany.

 

2012

High-content imaging system

Funded by the DFG's "Major Research Instrumentation Programme."

 

2011

Accessing transport functionality of intracellular aquaporin-11 and a plasmodial nitrite/formate transporter: a cell-free process line (DFG, 3 years)

The cell-based production of transport proteins for functional analysis is difficult due to low yields and intracellular mislocation. Proteins from intracellular organelles or intracellular parasites are particularly difficult and tend to be neglected despite their important physiological roles, such as the hardly characterized intracellular human aquaporin-11 (AQP11 ko-mice die of polycystic kidneys within two months) and a putative nitrite/formate transport protein, PfFocA, from the intraerythrocytic malaria parasite with the potential of becoming a novel therapeutic target. We want to set up a process line of cell-free systems for in vitro translation, liposome-based water and solute assays, and solid support membrane ion transport studies of AQP11 and PfFocA. We will optimize protein production using an open, continuous exchange cell-free system in precipitation mode and with detergents added. We will try yeast expression for comparison. We will check for yield and folding, and will affinity purify and reconstitute the proteins into proteoliposomes. Osmotic water and gradient-induced solute permeability will be assayed by dynamic light scattering. For determination of gradient induced ion conductance, we will use a commercial system based on a lipid-coated gold sensor to which the proteoliposomes will be attached. We will critically fathom the limitations and opportunities of our cell-free approach and its potential for translation to other problematic as yet inaccessible water/solute/ion transport proteins.

 

2008

Regulation und gating von neuen Aquaporinen aus dem Schleimpilz Dictyostelium discoideum und deren Funktion für die Zellmotilität (DFG, 3 years)

Wir wollen grundlegende Funktionen von zellulären Wasserkanälen (Aquaporine, AQP) für die Zellwanderung untersuchen. Dazu haben wir drei neue Aquaporine im Dictyostelium-Genom identifiziert. Sie kodieren wahrscheinlich für zwei Aquaglyceroporine (DdAQP1 und 3) und einen wasserspezifischen Kanal (DdAQP2). Per RT-PCR haben wir AQP-Expression erstmals im amöboiden Einzellstadium nachgewiesen. DdAQP2 haben wir heterolog exprimiert und gezeigt, dass die Verkürzung einer intrazellulären Schleife den Wasserkanal öffnet. Es scheint also ein gating, wir vermuten durch Phosphorylierung, vorzuliegen. Wir werden durch Mutationen der Aminosäuresequenz und Funktionsassays den gating-Mechanismus des DdAQP2 analysieren. Wir werden mit Antikörpern gegen DdAQP2 das Expressionsprofil während der Dictyostelien-Entwicklung und die intrazelluläre Lokalisation während der Zellwanderung untersuchen. Phospho-spezifische Antiseren werden wenn machbar hergestellt. Wir werden DdAQP2 in Dictyostelien deletieren, durch permanent geöffnete oder geschlossene Mutanten ersetzen und den Effekt auf die Motilität video-mikroskopisch analysieren. Analog werden DdAQP1 und 3 auf deren Funktion untersucht, die in der Osmo-Protektion, dem Metabolitentransport oder der Zellmotilität liegen könnte.

 

Biochemische und elektrophysiologische Charakterisierung des Aquaporin-Kationenfilters (DFG, 2 years)

Wir haben durch wenige (1-3) Punktmutationen in Aquaporinen physiologisch relevante Leitfähigkeiten für Protonen, Ammonium, Kalium- bzw. Natriumionen erzeugt. Es ist also erstmals gelungen, den Aquaporin-Kationenfilter im Protein zu lokalisieren und zu zerstören. Beteiligt ist nicht nur die zentrale Porenregion (Asparagin-Prolin-Alanin-Sequenzmotiv) sondern auch die Engstelle am Poreneingang (aromatische Arginin-Region). Diese experimentellen Daten ermöglichen es nun, die existierenden theoretischen Modelle, die meist die zentrale Region allein für den Kationenausschluss verantwortlich machen, zu überprüfen. In der Fortsetzungsphase des Projekts werden wir die erhaltenen Aquaporin-Mutanten u.a. von Säuger-AQP1, Toxoplasma TgAQP und Plasmodium PfAQP in geeigneten Zellen (E. coli, Hefe, Xenopus Oocyten, Säugerzellen) exprimieren. Zudem werden wir den Einfluss von aromatischen Resten auf den Ionentransport (Kationen-pi-Interaktion) durch Mutationen untersuchen. Wir werden phänotypische Hefe-Assays (Ammonium, Kalium), Elektrophysiologie mit Oocyten (Protonen, Ammonium, Natrium, Chlorid), osmotische stopped-flow Assays (Wasser, Glycerol) sowie zelluläre Assays zum Protonenfluss mit pH-sensitivem green fluorescent protein (pHlourin) etablieren und die Leitfähigkeiten analysieren.

 

2007

Structure function analysis of membrane transporters and channels for the identification of potential drug target sites. (EC, 3 years)

(FP7 EU project; EDICT associate partnership)

 

2006

Mechanismen des Protonenausschlusses von Aquaporinen und Etablierung eines stopped-flow Assay-Systems (DFG, 2 years)

Wir haben durch die Mutation Arg195Val an der Poren-Engstelle des wasserspezifischen AQP1 das erste Protonen-leitende Aquaporin generiert. Der Strom von etwa 50 Protonen pro Sekunde gemessen in Oocyten des Krallenfroschs ist klein. Entsprechend theoretischer Molekulardynamik/Quantenmechanik-Simulationen befindet sich der Hauptprotonenfilter im Zentrum des Porenkanals, der von zwei anscheinend invariablen, kanonischen Asparaginen gebildet wird. Wir haben im Genom von Burkholderia cenocepacia aber ein untypisches Aquaporin (BccGlpF) identifiziert, das anstelle von Asparagin ein Serin (Pos. 186) trägt. Wir wollen erstmals Selektionsmechanismen der zentralen Asparagine des BccGlpF sowie prototypischer Aquaporine mit der hier beantragten stopped-flow Apparatur untersuchen. Das klassische Oocytensystem exprimiert keine bakteriellen Aquaporine, ist zu unflexibel und zu unverläßlich für die geplanten Analysen. Wir werden verschiedene Asparagin-Mutanten der Aquaporine herstellen, in Vesikel-akkumulierender Hefe exprimieren und die sekretorischen Vesikel präparieren. Wir werden stopped-flow Assays zur Bestimmung der Wasser-, Solut- und Protonenleitfähigkeit etablieren, die Änderungen der Lichtstreuung schrumpfender Vesikel bzw. der Fluoreszenz pH-sensitiver Farbstoffe im Vesikel messen.

 

2005

Permeabilität der Aquaglyceroporine aus Plasmodium und Toxoplasma für Ammoniak und dessen Derivate (DFG, 2 years)

Wir haben im bisherigen Antragszeitraum Aquaglyceroporine aus Plasmodien, Toxoplasma und Trypanosomen als Wasser- und Solutkanäle charakterisiert und molekulare Selektions-mechanismen durch Mutationsanalyse identifiziert. Im Rahmen des Fortsetzungsantrags wollen wir erstmals deren Leitfähigkeit für Ammoniak untersuchen, da in den Genomen dieser Parasiten keine typischen Ammoniak/-ium-Transporter identifiziert werden konnten. Dafür werden wir einen etablierten Hefe-Stamm, dessen drei endogene Ammoniumtransporter deletiert sind, durch zusätzliche Deletion des endogenen Hefe-Aquaglyceroporins als Assay-System für die Ammoniak-Leitfähigkeit von Aqua(glycero)porinen zugänglich machen. In diesem neuen Testsystem werden wir die Aufnahme von Ammoniak und die Abgabe von zelltoxischem Methylammoniak durch Aquaglyceroporine aus Parasiten sowie der Hefe prüfen. Wir werden parallel im Xenopus laevis Oocyten-System die selektive Ammoniak-Aufnahme testen durch die Acidifizierung des Mediums, die Aufnahme von radioaktiv markiertem Methylammoniak sowie die induzierten Ionenströme. Wir werden die Toxizität von Ammonium für Plasmodien in Kultur exakt bestimmen (IC50) und die Abgabe von Ammonium in das Medium im Verlaufe der Kulturdauer abhängig vom Entwicklungsstadium biochemisch untersuchen.

 

2004

MalariaPorin: Validation of the Plasmodium aquaglyceroporin as a drug target  (EC, 3 years, FP6 EU project)

Malaria is one of the three major infectious diseases. Although the disease is prevalent in the tropics and subtropics it has caused a global emergency. 300-400 million cases with 1-2 million deaths per year and rapidly increasing resistance to antimalarial drugs call for focused novel strategies on combating malaria. Transport proteins for nutrients and metabolites of the minimal parasite/host interface are getting into the focus of the current search for novel antimalarial targets. MalariaPorin is an interdisciplinary project that wants to take genomic information to drug development. The chief goal is to decide on the question whether the Plasmodium water and glycerol channel, aquaglyceroporin, of the parasite/host interface is a suitable drug target for chemotherapy. Concurrently, the conditions for generating aquaglyceroporin inhibitory drugs are developed. To achieve these goals, a multidisciplinary approach is taken covering a) thorough studies on the physiological role of water and glycerol transport in the malaria parasite including the generation of deletion strains; b) establishment of robust and practical assay systems for compound testing based on Xenopus laevis oocytes, yeast and P. falciparum parasites; c) determination from field isolates of the occurrence and functional consequences of polymorphisms of the aquaglyceroporin gene; d) generation of protein structure models and elucidation of the 3D structure from protein crystallisation for solving mechanistic questions on the channel selectivity and for virtual drug design; e) design and synthesis of compound libraries based on the knowledge of other aquaporin blockers and biochemical studies of substrate specificity. It is envisioned that MalariaPorin may become the starting point for a wider strategy to assess the role of aquaporins in pathogenic parasites, such as Toxoplasma gondii and Trypanosoma brucei and cruzi, and their potential use as drug targets.

 

2002

The molecular basis of the transport properties of the aquaglyceroporin from Plasmodium falciparum (DFG, 2 years)

We characterized an aquaglyceroporin from Plasmodium falciparum (PfAQP). PfAQP is most similar to the glycerol facilitator protein glpF of E. coli, but is distinguished by its high permeability for glycerol and water. We wish to carry out mutational analyses of selected pore lining amino acids. We search for mutants with decreased water but unimpaired glycerol permeability. We measure the flux rates by Xenopus oocyte swelling in osmotic and glycerol gradients. Once such mutants are identified we will try to prove the function of the respective amino acids by introducing the mutations in reverse into glpF to obtain a gain of function mutant with good water permeability. Other microorganisms, such as Mycoplasma sp., Streptococcus pneumoniae and Thermotoga maritima, carry, like P. falciparum, a single putative aquaglyceroporin gene. We will amplify the sequences from genomic DNA and compare the pore characteristics to PfAQP. In P. falciparum cultures we will mimick hypoglycaemic situations with increasing glycerol and decreasing glucose concentrations. We will test for viability by FACS analysis and quantitate the expression levels / induction of PfAQP by quantitative Western blotting. We will analyze the expression of PfAQP in gametocytes by Western blot and immunofluorescence.

 

2000

Aquaporine des Innenohrs: Signaltransduktion und Volumenregulation der Endolymphflüssigkeit (DFG, 2 years)

Die Endolymphe ist eine hoch kaliumhaltige extrazelluläre Flüssigkeit, deren Ionen- und Volumenregulation für die sensorischen Innenohrfunktionen essentiell ist. Durch RT-PCR haben wir das Expressionsmuster von zellulären Wasserkanälen, Aquaporinen (AQP), quantitativ im Innenohr bestimmt. Im endolymphatischen Sack, dem Ort der Endolymph-Volumenregulation, fanden wir das nierenspezifische Vasopressin/cAMP-regulierte AQP2. Hinweise deuten auf einen umgekehrten Vasopressin-Effekt im Innenohr. Wir haben eine immortalisierte Zellinie des endolymphatischen Sacks (mES13) etabliert. Wir werden Aquaporine und Vesikeltransportproteine subzellulär lokalisieren und untersuchen die Kopplung von Vasopressin-Rezeptor und Adenylatcyclase durch Enzym-Assays. Wir exprimieren Fusionsproteine aus AQP2 und dem green fluorescent protein zur visuellen Verfolgung und Aufzeichnung des Vesikeltransports in mES13-Zellen. Wir bestimmen und charakterisiseren die Signalkette der AQP-2 Regulation. Wir identifizieren beteiligte Proteine durch Expressionshemmung mit anti-sense RNA. Der Effekt von Änderungen der Ionenkonzentration, besonders von Ca2+, auf die AQP-Regulation und -Expression im endolymphatischen Sack des Innenohrs wird untersucht.

 

1999

Aquaporine: AQP-6 im Innenohr und Regulation von AQP-2 (DFG, 1 year)

Zelluläre Wasserkanäle, Aquaporine (AQP), ermöglichen einen schnellen und regulierbaren Transport selektiv von Wasser und kleinen ungeladenen Molekülen über Zellmembranen entsprechend dem osmotischen Gradienten. Im Sammelrohr der Niere befindet sich Vasopressin reguliertes AQP-2, dessen Mutation nephrogenen Diabetes insipidus auslöst. Eine Dysregulation u. a. des Endolymphvolumens im Innenohr ist Ursache für Schwindel und Hörverlust (Morbus Meniere). Wir haben AQP-2 (neben AQP-1, -3, -4 und -5) und den V2-Vasopressinrezeptor im Innenohr nachgewiesen. Der Vasopressineffekt im Innenohr ist jedoch invers zum Sammelrohr, d.h. AQP-2 wird negativ reguliert. Ich möchte die Bedeutung der AQPe für die Innenohrfunktion weiter untersuchen, durch: 1) Suche nach dem bislang nierenspezifischen AQP-6 mit RT-PCR und, falls vorhanden, Hefeexpression und Charakterisierung. 2) Identifizierung regulativer Proteine des AQP-2 durch Chromatographie an mit phosphoryliertem AQP-2 gekoppelten Affinitätsmaterial und Immunpräzipitation von AQP-2-Proteinkomplexen. AQP-2 wird mit N-terminalem myc-tag in Hefe exprimiert, gereinigt und mit Sammelrohr-Zelllysat homogenisiert. Komplexe werden mit anti-myc-Antikörpern gefällt und isolierte Proteine ansequenziert.

 

1998

Aquaporine und Nukleotidcyclasen: Lokalisation und funktionelle Verknüpfung im Innenohr (DFG, 2 years)

Mit RT-PCR sind die Expressionsmuster der Adenylat- und Guanylatcyclase Isoformen in Innenohrgeweben quantitativ bestimmt worden. Zusätzlich wurden Transkripte f¨ur Wasserporen, Aquaporine, identifiziert, darunter im endolymphatischen Sack das Vasopressin/cAMP regulierte, bislang Nieren-spezifische Aquaporin-2. Dies ist wichtig für die Regulation der ionischen Zusammensetzung der Endolymphe im Innenohr mit 144 mval/L extrazellulärem K+. Die Endolymphe ist direkter Teilnehmer an der Signaltransduktion und Modulation des Innenohrs. Wir untersuchen quantitiv das Aquaporin Expressionsmuster mit RT-PCR in funktionell abgegrenzten Innenohrbereichen. Mit in situ Hybridisierung und Immunhistochemie wird die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Cyclasen und Aquaporinen bestimmt. Schwerpunktmäßig wird dann die Regulation der Wasserleitfähigkeiten im endolymphatischen Sack und der Reißner'schen Membran untersucht. Im endolymphatischen Sack wird die Vasopressin-cAMP-Aquaporin-2 Verknüpfung fluorimetrisch direkt gemessen. Durch heterologe Expression von Aquaporinen in Xenopus Oocyten und sf9-Zellkultur wird deren Regulation durch posttranslationale Modifikationen in vitro und in vivo auf molekularer Ebene bestimmt.